Посещений:
Polycomb Группы Белки

Участие в Транскрипционном Молчании

TRANSCRIPTIONAL SILENCING BY POLYCOMB CROUP PROTEINS
U.Crossni Klaus, R.Paro
Epigenetics, Cold Spring Harbor (N.Y.), 2007.- Chap.11, P.211-230

The organs of humans, animals, and plants are constructed from a large pool of distinct cell types, each performing a specialized physiological or structural function. With very few exceptions, all cell types contain the same genetic information encoded in their DNA. Thus, the distinctiveness of a given cell type is achieved through specific gene expression programs. However, cell lineages need to have these programs of gene expression maintained during growth and cell division. This implies the existence of a memory system that ensures a faithful transmission of information for which gene has to be active or repressed from mother to daughter cells. The existence of such a system is illustrated by the fact that cultured tissues of plants and animals usually maintain their differentiated characters even if grown in a foreign environment. By way of example, ivy plants regenerated after tissue culture produce the type of leaf corresponding to the phase of development from which the original tissue was taken (i.e., juvenile or adult leaf).
The major question to be addressed in this and the following chapter concerns the molecular identity of factors contributing to the mechanism(s) which maintains determined states over many cell divisions (a process termed "cellular memory" or "transcriptional memory"). Genetic analyses in Drosophila have identified regulators crucial in maintaining the fate of individual body segments that are determined by the action of the HOX genes. In Drosophila males, the first thoracic segment has legs with sex combs. Legs on the second and third thoracic segment lack these structures (see the left panel of the title images). In the 1940s, Drosophila mutants were identified (Polycomb and extra sex combs) where males had sex combs on all legs (see the right panel of the title images). They correspond to homeotic transformations of the second and third leg identities into the first leg identity. Genetic and molecular studies showed that these mutations did not affect the products of the HOX genes themselves, but rather the way HOX gene activity was spatially controlled. Over the years, a large number of such regulatory genes were identified, which could be classified into two antagonistic groups, the Polycomb (PcG) and trithorax (trxG) groups. Whereas the PcG proteins are required to maintain the silenced state of developmental regulators such as the HOX genes, the trxG proteins are generally involved in maintaining the active state of gene expression. Thus, PcG and trxG proteins form the molecular basis for cellular memory.
Proteins of the PcG and trxG are organized into large multimeric complexes that act on their target genes by modulating chromatin structure. In this chapter, we focus on the molecular nature and function of two major Polycomb Repressive Complexes, PRC1 and PRC2; the molecular nature of the trxG complexes is described in the next chapter. PcG complexes are recruited to target genes through a DNA sequence called a PcG Response Element (PRE) in Drosophila. Once recruited, they establish a silent chromatin state that can be inherited over many cell divisions. Members of PRC2 are conserved between plants and animals, whereas PRC1 proteins are only present in Drosophila and vertebrates. This implies conservation but also diversity in the basic building blocks of the cellular memory system. In addition to their function in the maintenance of cell types, PcG complexes may also play important roles in stem cell plasticity. Their deregulation can lead to neoplastic transformation and cancer in vertebrates. Thus, PcG proteins are crucial for many fundamental processes of normal development and disease in multicellular eukaryotes.
Все многоклеточные организмы начинаются с одиночной клетки, зиготы, которая во время развития дает множественные различающиеся типы клеток со специализированными функциями.

1.1 The Concept of Cellular Memory


Взрослое животное имеет 200-300 структурно отличающихся типов клеток, тогда как растения между 30 и 40. Если принять во внимание сложные паттерны экспрессии генов, то также можно будет различить огромное количество разнообразных популяций клеток. Качественные особенности и функция данного клеточного типа предопределяются характерными профилями генной экспрессии, где соотв. наборы генов или активны или молчат. Во время развития и гомеостаза у взрослых критическим является запоминание и точное воспроизведение этого состояния после каждого клеточного деления. Это особенно важно во время репликации генетического материала (S фаза) и разделения хромосом во время митозов (M фаза), которые являются повторяющимися событиями в каждом клеточном цикле, который прерывает процесс генной экспрессии. Как же поддерживаются паттерны дифференциальной генной экспрессии от одной клеточной генерации к другой?
Из экспериментов 1960s и 1970s известно, что растительные и животные ткани "запоминают" детерминированное состояние даже после продолжительных пассажей в культуре (Hadorn 1968; Hackett et al. 1987). Hadorn с коллегами показали, что клетки имагинальных дисков, обнаруживаемые у личинок Drosophila обладают наследуемой клеточной памятью, благодаря которой они запоминаю детерминированные состояния которые фиксированы в раннем эмбриогенезе. Имагинальные диски являются кластерами эпителиальных клеток, закладываемых вне развивающегося эмбриона, которые являются предшественниками специфических наружных структур и придатков во время метаморфоза. Напр., из двух пар имагинальных дисков во втором торакальном сегменте, одна формирует среднюю пару ног, а другая крылья (see Fig. 2 in Chapter 12). Имагинальные диски могут быть культивированы после трансплантации в гемоцель взрослых самок, где они продолжают пролиферировать, но не дифференцируются. Будучи трансплантированными обратно в личинок до метаморфоза, диски последовательно дифференцируются в ожидаемые взрослые структуры, даже посел последовательных трансплантационных пассажей. Сравнительно недавно было установлено, что PcG и trxG белки необходимы для поддержания детерминированного состояния клеток имагинальных дисков (Fig. 1). В этих экспериментах, однако наблюдалось, что в редких случаях имагинальные диски могут менять свою судьбу, процесс был назван трансдетерминацией. Этот процесс использует подавление PcG репрессии за счет JNK сигнального каскада в трансдетерминированных клетках (Fig. 2 a,b) (Lee et al. 2005). PcG мутанты также обнаруживали повышенные частоты трансдетерминаций, подтверждая тем самым роль белков PcG в поддержании судеб клеток имагинальных дисков (Klebes et al. 2005). Т.о., белки PcG, по-видимому, играют критическую роль в репрограммировании клеточных судеб как во время нормального развития, так и в процессах регенерации (see Section 4.3 for more detail).

1.2 Genetic Identification of the Polycom b Croup


У всех метазоа передне-задняя ось специфицируется благодаря определенным паттернам экспрессии HOX генов (see Fig. 2 in Chapter 12). Во время эмбриогенеза у

Figure 1. The Concept of Cellular Memory Schematic illustration of the involvement of PcG and trxG complexes in the determination of active and repressed states of gene expression and, thereby, cellular differentiation, which is maintained over many cell divisions. (TA) Transcriptional activator; (TR) transrciptional repressor.

Drosophila, активность материнских (т.e., унаследованных через ооцит) и зиготически продуцируемых транскрипционных факторов генерирует специфическую комбинаию экспрессии HOX, необходимую для каждого сегмента. Этот сегмент-специфический профиль активностей HOX генов поддерживается в ходе всего развития мух, спустя много времени после того, как ранние транскрипционные регуляторы исчезают. Когда функция HOX генов была генетически охарактеризована, то были изолированы многочисленные транс-действующие регуляторы. Среди них был идентифицирован Polycomb (Pc) и генетически проанализирован Pam and Ed Lewis (Lewis 1978).



Figure 2. Homeotic Transformations in PcC Mutants of Various Species (a-d) Drosophila melanogaster, (e, f) Mus musculus, (g, h) Arabidopsis thaliana. (a, b) Leg imaginal discs undergoing a trans-determination event as indicated by the expression of the wing-specific gene vestigial (which is marked by CFP). (c, d) Cuticles of a wild-type (c) and a Su(z)12 mutant embryo (d). In the Su(z)12 mutant embryo, all abdominal, thoracic, and several head segments (not all visible in this focal plane) are homeotically transformed into copies of the eighth abdominal segment due to misexpression of the Abd-Bgene in every segment, (e, f) Axial skeleton of newborn wild-type (e) and Kng1Ah mice (f). Views of the thoracic regions of cleared skeletons showing bone (red) and cartilage (blue). The mutant displays anterior transformation of the eighth thoracic vertebra as indicated by the presence of eight (1-8) vertebrosternal ribs, instead of seven (1-7) as in the wild type, (g, h) Wild-type (g) and clf-2 mutant (h) flowers. The wild-type flower shows the normal arrangement of sepals, petals, stamens, and carpels. In the clf-2 flower, petals are absent or reduced in number. (a,b, Courtesy of N. Lee and R. Paro; c,d, reprinted, with permission, from Birve et al. 2001 [©Company of Biologists Ltd.]; e,f, reprinted, with permission, from del Mar Lorente et al. 2000 [©Company of Biologists Ltd.]; h, courtesy of). Goodrich.)

Гетерозиготные Pc мутантные самцы имели дополнительные половые гребешки на второй и третьей парах ног, тогда как самцы дикого типа имели половой гребешок только на первой паре ног (see title figure). Гомозиготные мутанты оказались эмбриональными леталями, обнаруживающими трансформации всех кутикулярных сегментов в направлении более задних абдоминальных сегментов (Fig. 2c,d). Эти классические PcG фенотипы были интерпретированы как результат эктопической экспрессии HOX генов. Т.о., Pc и др. гены со сходными фенотипами были определены как репрессоры активности HOX генов. Детальный анализ последовательно выявил тот факт, что белки PcG необходимы только для поддержания репрессии HOX скорее, чем для зависимого от позиции установления активности HOX во время формирования паттерна. Эта последняя цель осуществляется с помощью транскрипционных факторов, кодируемых рано действующими генами сегментации. Исходя из их репрессирующего или активирующего эффекта на экспрессию HOX генов, эти новые идентифицированные транс-действующие регуляторы были подразделены на два антагонистических класса, PcG и trxG, соотв. (Fig. 1) (Kennison 1995).
Молекулярное выделение у дрозофилы генов PcG позволило изучить функцию позвоночных ортологов у мышей, где они также оказались ключевыми регуляторами экспрессии HOX генов (van der Lugt et al. 1994; Core et al. 1997). У млекопитающих мутации в генах PcG ведут к гомеозисным трансформациям позвонков (Fig. 2e,f). Кроме того PcG гены играют критическую роль в контроле клеточной пролиферации, поддержании стволовых клеток и возникновении раковых опухолей (see Sections 4.2 and 4.3). Удивительная консервация PcG генов у мух и млекопитающих облегчило генетический анализ и привело к идентификации некоторых новых членов PcG комплексов, напр., the RING1 белка (Satijn and Otte 1999). Целенаправленные мутации RING la у мышей, напр., давали фенотип классической гомеозисной трансформации. Только впоследствие было установлено соответствие PcG гену Sex combs extra у Drosophila.
У двух др. модельных организмов, а именно, у Caenorhabditis elegans и цветкового растения Arabidopsis thaliana, молекулярная характеристика мутантов, выделенных при разных генетических скринингах, выявила существование др ортологов белков PcG. У C. elegans, члены PcG были идентифицированы при скрининге на maternal effect sterile (mes) мутации и было показано вовлечение в X-хромосомное молчание в зародышевой линии гермафродитов (Fong et al. 2002; see Chapter 15).
У Arabidopsis, PcG гены были идентифицированы в нескольких генетических скринингах при исследовании различных онтогенетических процессов (Hsieh et al. 2003). Первый PcG ген у растений, CURLY LEAF (CLF), был идентифицирован как мутант с гомеозисными трансформациями органов цветка (Fig. 2g,h) (Goodrich et al. 1997). Мутации в FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED (FIS) классе генов были найдены при скрининге мутаций, обнаруживающих материнский эффект на абортацию семян (Grossniklaus et al. 1998), или допускающих некоторые аспекты развития семян, происходящие в отсутствие оплодотворения (Luo et al. 1999; Ohad et al. 1999). Наконец, PcG гены были идентифицированы при скрининге мутаций времени цветения, напр., мутанты, которые цвели непосредственно после проращивания (Yoshida et al. 2001) или такие, которые нарушали реакцию vernalization response, т.e., процесс наделения растений компетентностью цвести после продолжительного воздействия холодом (Gendall et al. 2001).
Разнообразие процессов, регулируемых с помощью PcG белков иллюстрирует важность поддержания репрессированного состояния ключевых онтогенетических регуляторов у разных организмов. С одной стороны, имеется удивительная консервация некоторых биологических функций от растений до млекопитающих, напр., регуляция ключевых регуляторов онтогенеза, таких как гомеозисные гены, или вовлечение в тонкую регулировку пролиферации клеток. С др. стороны, PcG комплексы, по-видимому, многосторонние и динамические молекулярные модули, которые участвуют в контроле большого разнообразия онтогенетических и клеточных процессов.

2 Establishing Silencing Marks on Chromatin


Белки PcG распадаются на два биохимически охарактеризованных класса, которые формируют Polycomb репрессивные комплексы 1 и 2 (PRC1 и PRC2). Два комплекса необходимы для последовательных ступеней репрессии генной экспрессии. Во-первых, PRC2 обладает гистон-модифицирующей активностью и метилирует H3K27 и/или H3K9 в генах, нацеленных молчать. Компоненты PRC1 могут затем распознавать и соединяться с такими модификациями и индуцировать соотв. структурные изменения в хроматине. В то время как PRC2 белки присутствуют у всех многоклеточных модельных организмов, компоненты PRC1 не были идентифицированы у C. elegans и Arabidopsis.

2.1 Components and Evolutionary Conservation of PRC2


Некоторые варианты PRC2 были очищены из эмбрионов Drosophila, но все эти комплексы содержат 4 стержневых белка (Levine et al. 2004): SET histone-methyltransferase Enhancer of Zeste (E(Z)), WD40 белок ESC, гистон-связывающий белок p55 и Suppressor of Zestel2 (SU(Z)12) (Table 1 and Fig. 3). Исходя из этого состава, PRC2 первоначально был обозначен как E(Z)-ESC комплекс.
Ген E(z) кодирует белок в 760 аминокислот, содержащий SET домен, который отвечает за histone lysine methyl-transferase (HKMT) активность. Домену SET предшествует CXC или Pre-SET домен (Tschiersch et al. 1994), который содержит 9 законсервированных цистеинов, которые связывают три иона цинка и, как полагают, стабилизируют SET домен. Такая структурная роль подтверждается тем фактом, что некоторые чувствительные к температуре E(z) аллели затрагивают один из законсервированных цистеинов (Carrington and Jones 1996). Кроме того, E(z) содержит SANT домены, участвующие в связывании гистонов и C5 домен, необходимый для физического взаимодействия с SU(Z)12.
ESC является коротким белком из 425 аминокислот, который содержит 5 WD40 повторов, которые, как установлено, формируют 3 propeller структуры. Они служат в качестве платформы для межбелковых взаимодействий, исходя из этого ESC приписывается центральная роль в PRC2, он физически взаимодействует как с E(z), так и p55 во всех проанализированных модельных системах.
Белок SU(Z)12 длиной в 900 аминокислот характеризуется C2H2-типа цинковым пальчиком и С-терминальным VEFS доменом. Домен VEFS был идентифицирован как законсервированная область между SU(Z)12 и его тремя гомологами у растений: VRN2, EMF2, FIS2 (see Fig. 3). Несколько мутантных Su(z)12 аллелей изменяют этот домен, показывая, что он необходим для взаимодействия с C5 доменом E(Z) (Chanvivattana et al. 2004; Yamamoto et al. 2004).
Белок p55 не был идентифицирован как член PcG при использовании генетических подходов, возможно из-за того, что он участвует во множественных др. белковых комплексах, ассоциированных с хроматином (Hennig et al. 2005). Белок p55 был, однако, идентифицирован биохимически как часть PRC2. Он длиной в 430 аминокислот и содержит 6 WD40 повтора, которые физически взаимодействуют с ESC или его ортологами у млекопитающих и растений (Tie et al. 2001; Kohler et al. 2003a).
В дополнение к стержневым PRC2 белкам, некоторые варианты комплексов содержат RPD3 histone deacetylase (HDAC) или Polycomb-like (PCL) белок. Взаимодействие с RPD3 заслуживает внимание, т.к. деацетилирование гистонов коррелирует с репрессированным состоянием генной экспрессии (see Chapter 10). Разные составы PRC2 скорее всего отражают динамические изменения во время развития или как ткане-специфические варианты.
PRC2 высоко законсервирован у беспозвоночных, позвоночных и растений (Fig. 3). У C. elegans, присутствуют только гомологи E(Z) и ESC: MES-2 и MES-6. Вместе с др. не законсервированным белком, MES-3, они образуют небольшой комплекс примерно в 230 kD, необходимый для молчания Х хромосомы в зародышевой линии гермафродитов (see Chapter 15). У растений и млекопитающих все 4 стержневых белка PRC2 присутствуют. Как и у Drosophila, комплекс у млекопитающих примерно в 600 kD и играет роль не только в регуляции экспрессии гомеозисных генов, но и также в контроле клеточной пролиферации, инактивации Х хромосомы и в экспрессии импринтируемых генов (see Section 4 and relevant chapters for more detail).
У растений, некоторые гены, кодирующие компоненты PRC2 подвергаются удвоениям, так что они теперь присутствуют как небольшое семейство генов. У Arabidopsis имеется только один гомолог ESC, FERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE), но три гомолога E(Z), три гомолога SU(Z) 12, и 5 гомологов p55 (обозначенных как MSI1-5) (Table 1). Варьирующие комбинации этих белков формируют, по крайней мере, 3 самостоятельных комплекса, которые контролируют специфические онтогенетические процессы (Figs. 3 and 4) (Reyes and Grossniklaus 2003; Chanvivattana et al. 2004).
Наиболее изученным из этих трех комплексов является формируемый член класса FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED (FIS), который играет критическую роль в контроле клеточной пролиферации в семенах (Grossniklaus et al. 2001). Этот FIS или MEA-FIE комплекс содержит MEDEA, FIE, FIS2 и MSI1.

Table.1. Core PcG genes in model systems





Figure 3. Conserved PRC2 Core Complexes The core members of PRC2 in D. melanogaster, M. musculus, A. thaliana, and C elegans are shown. In A. thaliana, an ancestral complex is proposed to have diversified into three variants with discrete functions in development. In C. elegans, the PRC2 core complex contains only three proteins: MES-3 does not have homology with any other identified PRC2 protein. The colors indicate homology, the contacts indicate interactions. (Adapted from Reyes and Grossniklaus 2003 and Chanvivattana et al. 2004.)

FIS комплекс, как было установлено, регулирует гены, кодирующие PHERES1 (PHE1), MADS доменовый транскрипционный фактор; и MEIDOS, гомолог Skpl, который у дрожжей играет критическую роль в контроле клеточной пролиферации (Kohler et al. 2003b). Интересно, что отцовский аллель PHE1 экспрессируется на более высоком уровне, чем материнский. Такая регуляция генной экспрессии с помощью геномного импринтинга находится под контролем FIS комплекса, который специфически репрессирует материнский аллель (Kohler et al. 2005). Т.о., как будет показано ниже комплекс FIS обладает сходством функций со своим аналогом у млекопитающих по регуляции клеточной пролиферации, а также экспрессии импринтируемых генов.
Комплекс EMF содержит CLF и EMBRYONIC FLOWER2 (EMF2) (Chanvivattana et al. 2004). Мутации в любом из них обнаруживают слабые гомеозисные трансформации и фенотип раннего цветения. EMF комплекс необходим для репрессии гомеотических генов, комбинированное действие которых предопределяет качественные особенности органов цветка (Goodrich et al. 1997). Т.о., комплекс EMF обладает сходной функцией в поддержании репрессированного состояния гомеозисных генов как и PRC2 у Drosophila и позвоночных (Fig. 2). Однако, гомеотические гены у растений не кодируют гомеодоменовые белки, а скорее др. транскрипционные факторы, относящиеся к MADS-доменовым и специфичным для растений AP2-доменовым семействам. Сильные мутации EMF2, однако, имеют более тяжелый фенотип, при котором их проростки дают цветки сразу после прорастания, обходя в развитии фазу вегетации (Yoshida et al. 2001). Т.о., комплекс EMF играет роль как в раннем развитии, где они предупреждает немедленное цветение, так и в позднем органогенезе растений (floral organogenesis) (Chanvivattana et al. 2004). На обеих стадиях комплекс EMF репрессирует растительные гомеозисные гены, такие как AG и APETALA3 (AP3) (Fig. 4). Белки класса FIS, FIE и MSI1, участвуют также в контроле экспрессии гомеотических генов (Figs. 3 and 4). Т.к. мутации обоих вызывают эмбриональную летальность как материнский эффект, эта функция выявляется только, когда исследуются аллели с частичной потерей функции на поздних ст. развития (Kinoshita et al. 2001; Hennig et al. 2003).
Наконец, комплекс VRN играет ключевую роль в хорошо известном эпигенетическом процессе: vernalization (увеличенное воздействие низкой температуры). Такая яровизация индуцирует цветение озимых, но эффект наблюдается только после множественных клеточных делений (Fig. 4). Растительные клетки д. помнить, что они яровизированы, в течении многих месяцев или даже лет, после холодного периода. Такая клеточная память поддерживается посредством пассажей в клеточной культуре, но не от одного поколения к следующему (Sung and Amasino 2004a). Гены VERNALIZATION (VRN) обеспечивают реакцию на яровизацию. VRN2, ка к было установлено, кодирует гомолог SU(Z)12 (Gendall et al. 2001), который взаимодействует с растительными гомологами E(Z), CLF и SWINGER (SWN) в дрожжевых двугибридных испытаниях (Chanvivattana et al. 2004). Переход к цветению не только контролируется с помощью яровизации, но и использует воздействие эндогенных (стадия развития и возраст), так и экзогенных факторов (длина дня, условия освещения, температура). Были выявлены 4 пути с помощью генетического анализа: (1) автономный путь, постоянно репрессирующий цветение, (2) photoperiod путь, ускоряющий цветение в условиях длинного дня, (3) путь яровизации, индуцирующий цветение в ответ на воздействие холодной температуры и (4) gibberellins способствующие цветению. Ген времени цветения FLC,



Figure 4. Involvement of Distinct PRC2$ at Various Stages of Plant Development During the plant life cycle, distinct variants of PRC2 (see Fig. 3) control developmental progression. (A) A cleared wild-type ovule harboring the female gametophyte in its center. The FIS complex represses target genes that control proliferation of the central cell; as in all fa class mutants, this cell proliferates in the absence of fertilization. Around fertilization, MEA is also required to maintain a low level of MEAm expression, but this activity is independent of other components of the FIS complex. (8) Section of a wild-type seed harboring the embryo and endosperm, enclosed by the seed coat. After fertilization, the FIS complex is involved in the control of cell proliferation in embryo and endosperm. It maintains a low level of expression of PHE1 and is required to keep the paternal MEAf allele silent. (Q Wild-type (right) and emf2 mutant (left) seedling 21 days after germination. The emf2 seedling produced a flower with homeotic transformations but no leaves. The EMF complex prevents flowering and represses floral homeotic genes such as AC, AP3, and others. (D) Vernalized (right) and non-vernalized (left) plants, the latter being characterized by a prolonged vegetative phase and the production of many leaves. During the vegetative phase of development, exogenous and endogenous signals induce flowering. Vernalization leads to the repression of the floral repressor PLC and thus promotes flowering. The maintenance of this repression depends on the VRN complex. (Ј) Wild-type Arabidopsis flower. During flower organogenesis, the EMF complex regulates floral homeotic genes that determine the identity of floral organs. (A, Courtesy of J.M. Moore and U. Crossniklaus; B, courtesy of j.-P. Vielle-Calzada and U. Crossniklaus; C, reprinted, with permission, from Moon et al. 2003 [©ASPB]; D, reprinted, with permission, from Sung and Amasino 2004a [©Elsevier]; E, reprinted, with permission, from Page and Grossniklaus 2002 [©Macmillan].)

который содержит MADS бокс, яво\ляется ключевым интегратором в реакции цветения: он репрессирует цветение. Экспрессия FLC редуцируется как с помощью яровизационного, так и автономного пути. В то время как инициальная репрессия с помощью FLC не зависит от комплекса VRN, поддержание репрессии нуждается в VRN2, который изменяет организацию хроматина в локусе FLC (Gendall et al. 2001). Отметим, что одним из компонентов автономного пути components является гомолог p55, FVE (или MSI4), который влияет на реакции времени цветения, то не действует в пути яровизации (Ausin et al. 2004; Kim et al. 2004).Т.к. биохимических исследований комплекса VRN не проводилось, то точный состав его пока неизвестен (Figs. 3 and 4).

2.2 Chromatin-modifying Activity of PRC2


Как же PRC2 осуществляет свой репрессивный эффект? Некоторые белки из PcG и trxG имеют SET домены, включая PRC2 компонент E(Z). Открытие, что SET-доменовые белки обладают HKMT активностью (Rea et al. 2000) позволило предположить участие метилирования гистонов в функционировании PcG. В самом деле PRC2 комплексы млекопитающих и Drosophila ? как было установлено, метилируют гистон H3 по лизину 27 (H3K27) и в меньшей степени H3K9 in vivo и in vitro (Cao et al. 2002; Czermin et al. 2002; Kuzmichev et al. 2002; Muller et al. 2002). Эти гистоновые метки обычно ассоциируют с состоянием транскрипционного молчания. Более того, метилирование H3K9 и H3K27ассоциируют с репрессированными гомеозисными генами комплекса bithorax (Muller et al. 2002). Однако, только метилирование H3K27 теряется у мутантов E(z), подчеркивая тем самым важность метилирования H3K27 в обусловленном PcG молчании. В отличие от SU(VAR)3-9 белка, который метилирует H3K9 на себе самом, E(Z) белки на самих себя не оказывают H3K27 HKMT активности. Самый маленький комплекс, действующий как HKMT, также нуждается в ESC и SU(Z)12, которые могут выполнять модулирующие функции. Недавно было показано, что PRC2 комплексы могут также метилировать H1K26 (Kuzmichev et al. 2004). Удаленная изоформа гомолога ESC млекопитающих, Eed, детерминирует специфичность PRC2 млекопитающих в отношении метилирования H1K26 в противоположность H3K27 (Kuzmichev et al. 2004). Однако, функциональное значение метилирования H1K26 PcG молчания остается неясным.
У растений активность HKMT комплексов PRC2 еще не была продемонстрирована in vitro. Однако, исследование регуляции FLC показало, что яровизация индуцирует потерю его ацетилирования и усиливает метилирование H3K9 и H3K27, в основном за счет первого интрона гена (Bastow et al. 2004; Sung and Amasino 2004b). Обе метки метилирования теряются у мутантов vrn2, указывая на участие VRN комплекса в становлении этих репрессивных меток метилирования гистонов. У двух др. мутантов, vrnl и vernalization insensitive3 (vin3), отсутствует только метка H3K9me2. VRN1 и VIN3 кодируют транскрипционные факторы B3-доменовых и гомеодоменовых семейств, соотв., но точный молекулярный механизм их участия в модификации хроматина пока неясен.
По данным многочисленных исследований основная функция PRC2, по-видимому, связана с HKMT активностью, но присутствуют и др., хроматин-модифицирующие активности в некоторых PRC2 вариантах. Ген Rpd3 кодирует HDAC, которая участвует в PcG молчании (Tie et al. 2001). Однако, хотя мутации rpd3 и усиливают PcG фенотипы, они не обнаруживают типичных гомеозисных трансформаций сами по себе. Тот факт, что RPD3 присутствует не во всех PRC2 комплексах может отражать или слабое общее взаимодействие или ткане- и стадио-сецифичные взаимодействия со стержневыми компонентами PRC2. Взаимодействие RPD3 с PRC2 представляет собой интересное партнерство, т.к. и HKMT и HDAC активности ассоциируют с молчащим хроматином и в комбинации они могут усиливать состояние транскрипционного молчания.

2.3 Dynamic Function of PRC2 during Development


Как указывалось выше PRC1 и PRC2 стержневые комплексы ассоциируются с разными факторами и могут играть роль в рекрутировании PcG комплексов на ткане-специфичные локусы мишени или роль в модулировании их активности (Otte and Kwaks 2003). Различные ступени PcG репрессии, показанные на Figure 5, иллюстрируют стадио-специфический состав PcG комплексов во время эмбриогенеза Drosophila. Пока было трудно охарактеризовать различия в отношении разных тканей или типов клеток у мух, т.к. экстракты из целых эмбрионов использовали обычно для биохимических очисток. Исследование. проведенные на млекопитающих и растениях, однако, четко показали, что PcG комплексы имеют разный членский состав в специфических тканях и что их состав меняется во время клеточной дифференцировки (Chanvivat-tana et al. 2004; Kuzmichev et al. 2005; Baroux et al. 2006). У млекопитающих уровни экспрессии генов PcG сильно отличаются от одной клеточной линии к др. PcG комплексы могут даже отличаться по генам мишеням в одной и той же клетке, указывая тем самым на очень динамичное поведение на разных стадиях развития. У Drosophila белки PcG поддерживают репрессированное состояние гомеозисных генов, установившееся во время раннего эмбриогенеза, тем самым фиксируются онтогенетические решения. Как только состояние молчания PcG мишеней фиксируется, оно д. оставаться в этом состояни на весь оставшийся период жизни индивида. У растений сходная ситуация может возникать с VRN комплексом:

Figure 5. Sequence of Events Leading to the PcC-dependent Repressed State of Gene Expression in Drosophila Embryos The original gene expression state of a PRE-regulated gene is determined by the activity of transcriptional regulators, either transcriptional repressors (TR) or activators (TA). Transcription through the PRE prevents the establishment of the "OFF" state and leads to the trxG-dependent "ON" state (for details, see Fig. 8 in Chapter 12). (o-b) A nontranscribed PRE binds specific DNA-binding proteins (e.g., PHO, PHOL, DSP1, or GAF) that are involved in the recruitment of the early PcG complex containing proteins of both PRC1 and PRC2. (c) This early PcG complex marks chromatin by E(Z)-dependent histone methylation. (d) Maintenance of the silent state occurs through interactions of the two distinct complexes, PRC1 and PRC2, in the absence of the original transcriptional repressor. Maintenance of PRC! is stabilized through binding of H3K27me3 via the chromodomain of PC. (e) PRC1 can compact chromatin, further establishing tightly condensed, silent chromatin.

будучи яровизированными гены мишени д. оставаться постоянно неактивными бесплодными и восстанавливаться только в следующем поколении. Др. растительные PRC2 комплексы, однако, по-видимому, отвечают быстрее на онтогенетические и средовые стимулы. Напр., одна из функций FIS комплекса заключается в репрессии клеточной пролиферации в отсутствие оплодотворения. После оплодотворения, однако, клеточная пролиферация быстро индуцируется, преимущественно благодаря дерепрессии PcG генов мишеней. Это указывает на то, что PcG репрессия является изначальным (default) состоянием, которое преодолевается с помощью пока неизвестного механизма, чтобы позволить нормальное течение развития. Инактивация PcG комплексов, как часть нормального цикла жизни растений, может объяснить отсутствие PRC1 белков у растений (Fig. 4). PRC1 играет важную роль в перманентной, стабильной и длительной инактивации генов мишеней. Такая перманентная инактивация д. быть вредной для развития растений, где часто PcG репрессия прекращается в ответ на соотв. стимулы.

3 Maintaining Transcriptional Silencing


3.1 Components of PRC 1


Молекулярный анализ продуктов PcG генов выявил структурно отличающуюся группу ассоциированных с хроматином белков. PRC1 содержит 4 PcG белка; Polycomb (PC), Polyhomeotic (PH), Posterior Sex Combs (PSC), и Ring 1 (dRingl/SCE) (see Table 1) (Francis et al. 2001). Они появляются в stoichiometric количествах и идентифицированы дополнительные белки партнеры в зависимости от материала, используемого для очистки. Родственный комплекс был очищен из клеток млекопитающих, подтверждая, что эти 4 субъединицы формируют суть PRC1 (Levine et al. 2002). Иммуноокрашивание политенных хромосом Drosophila с использованием антител, направленных против PRC1 белков, выявило паттерны перекрывающейся локализации, которые указывают на то, что эти белки кооперируют при определенном и общем наборе генов мишеней (Fig. 6a). Кроме того, приблизительно 100 полос обнаруживаются на хромосомах, прдоставляя доказательства, что HOX гены как раз являются частью крупной регуляторной сети, включая и др. гены мишени, предмет замалчивания с помощью PcG.
Ген PC кодирует белок в 390 аминокислот, содержащий chromodomain на своем N-терминальном конце. Этот законсервированный мотив имеет гомологию с HP1, белком Drosophila, необходимым для образования гетерохроматина (Paro and Hogness 1991; see also Chapter 5). Chromodomain, как затем было установлено, соединяется с метильными частицами на H3K27 и H3K9 (Bannister et al. 2001; Fischle et al. 2003). др. законсервированный домен присутствует на С-терминальном конце. Консервация, а также появление

Figure 6. Targeting of PRO to PREs on Polytene Chromosomes (a) Immunostaining of Drosophila polytene chromosomes to visualize the distribution of the PC protein. (fc>) Alignment of chromosome arms showing the overlap between predicted PRE sites on the Drosophila genome and the cytologically mapped PC-binding sites on polytene chromosomes. The two HOX gene clusters (ANT-C and BX-C) are prominent binding sites for PRCIs.

некоторых аберраций в мутантных аллелях, указывают на важность, еще неустановленной регуляторной функции в этой части белка. С-конец PC безразличен для нахождения белком замалчиваемых генов (выполняется chromodomain), но как было установлено, взаимодействует in vitro с нуклеосомами (Breiling et al. 1999). Указывает ли это на неоткрытый ещё мотив распознавания для др. гистоновых модификаций, ещё предстоит доказать. Для Pc2 человека продемонстрирована SUMO E3 лигазная активность, подчеркивая, что SUMO модификации являются важными метками в процессе PcG молчания (Kagey et al. 2003).
N-терминальная часть PSC белка законсервирована в прото-онкогене bmi-1 и гене супрессоре опухолей mel-18. Эта область содержит C3HC4 кольцевой пальчиковый мотив, который может обеспечивать субъядерную локализацию межбелковых взаимодействий. Кольцевой finger мотив участвует в субъядерной локализации Bmi-1/Mel-18, это коррелирует с клеточными трансформациями.
У Drosophila локус polyhomeotic (ph) удвоен, состоит из проксимального (ph-p) и дистального {ph-d) гена, имеющих существенную гомологию. Идентифицированы гомологичные мышиные PH белки. Все обладают законсервированным одиночным цинковым пальчиком и SAM (известным также как SEP или SPM) доменом. Этот домен был также найден в др. PcG белке, Sex Combs on the Midleg (SCM). SAM домены участвуют в межбелковых взаимодействиях, как было продемонстрировано, они участвуют в гомо- и гетеротипических взаимодействиях с др. белками. Эти находки подтверждают возможную функцию по генерации крупных ядерных комплексов, необходимых для молчания. В самом деле, PcG белки были локализованы в субъядерных фокусах, названных PcG тельцами, которые могут функционировать как компартменты молчания (Saurin et al. 1998).
Как упоминалось выше, dRINGl первоначально не был распознан как PcG член. Только биохимическая очистка открыла присутствие этого фактора с RING finger мотивом в PRC1, в котором, как полагают, он играет структурную роль (Francis et al. 2001; Lavigne et al. 2004). Белки RinglA и Ring IB из PRC1 млекопитающих, как было установлено ассоциируют с ubiquitylated H2A на неактивной X хромосоме, а поддержание этой гистоновой метки зависит от Ringl белков (de Napoles et al. 2004; Fang et al. 2004; Cao et al. 2005; for more detail, see Section 4.1 and Chapter 17).
Эти 4 белка представляют собой стержневую структуру PRC1. Однако, др. белки PcG, подобно SCM или Zeste белку, были обнаружены в ассоциации с комплексом (Otte and Kwaks 2003). Их молекулярная функция в PRC1 остается неясной. т.к. они, по-видимому, обладают дополнительными ролями в ядре; напр., функция активатора транскрипции у Zeste. Тем не менее др. PcG гены были идентифицированы по их роли в качестве транскрипционных регуляторов стержневых PcG генов (Ali and Bender 2004). А именно 3 PcG гена являются вышестоящими регуляторами генов, кодирующих компоненты PRC1. Негативные петли обратной связи среди компонентов PRC1, также как и компоненты позитивной регуляции PRC1 с помощью PRC2, ещё больше указывают на сложную перекрестно-регуляторную сеть среди PcG генов, чтобы гарантировать тонкую настройку белковых уровней в комплексах (Fig. 7a). Сходным образом комплекс регуляторных взаимодействий был описан для генов из FIS комплекса у Arabidopsis (Baroux et al. 2006).

3.2 Targeting PRC1 to Silenced Genes


Трансгенный анализ кластеров гомеозисных генов Drosophila открыл регуляторные элементы, которые необходимы для поддержания соотв. сегмент-специфической экспрессии HOX генов. Эти ДНК элементы - названные Polycomb Response Elements или PREs - поддерживают сегмент-специфическую экспрессию HOX генов после фазы эмбриональной инициации. PREs привлекают белки из PRC1, когда интегрированы в эктопических сайтах на политенных хромосомах, указывая тем самым, что они предопределяют сиквенс-специфичность для распознавания и закрепления PRCls генов мишеней. Однако, вопрос о PcG таргетинге является очень сложным. Размер функционально охарактеризованных PREs варьирует в пределах от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований, в него входят сайты связывания для многих различных ДНК-связывающих белков и обычно два или более PREs обнаруживаются в данном локусе мишени. Итак, все охарактеризованные PREs относятся к Drosophila и пока не установлены PREs у млекопитающих и растений. Несмотря на сложность PREs, мотивы 4-х консенсусных последовательностей

Figure 7. PRC1 Regulation and Function during Cell Division PRE-transcript (a) Cross-regulatory interactions among the PcG genes, as suggested from genetic evidence. E(Pc), Pel, and Asx are positive regulators of the core PRO members acting upstream. PRC2 members Esc and E(z) act as positive regulators of Pc transcription. A negative feedback by core PRC1 members on Psc and dRirtgl, as well as on Su(z)2, is observed. The fine-tuning of gene product level is probably required for well-balanced processes based on chemical equilibrium, (b) Sequence-specific transcription factors (TF) tether components of PRO to a PRE. A stable silencing complex requires anchoring of PRO via the chromodomain of PC to neighboring methylated histone tails, (c) Possible model for how differential gene expression states can be inherited. The process of intergenic transcription places positive epigenetic marks (e.g., acetylated histone tails, histone variants) at PREs that control active genes (PRE 2). All other PREs are silenced by default (PRE 1). During DNA replication and mitosis, only the positive epigenetic signal needs to be transmitted to the daughter cells, ensuring that in the next interphase intergenic transcription is restarted at PRE 2 before default silencing is reestablished at all other PREs. (a, Adapted from Ali and Bender 2004.)

были идентифицированы и было показано, что они играют роль в PRE функции у Drosophila. Один из таких мотивов (GCCAT) связывается как Pleiohomeotic (PHO), так и Pleiohomeotic-like (PHOL) белками, которые выполняют частично перекрывающиеся функции. Функция PHO и PHOL заключается в целевой поставке PcG, т.к. они обнаруживаются в PcG комплексах, выделенных из экстрактов ранних эмбрионов, ко-иммунопреципитируют с членами PRC1 и PRC2 и связывают PREs in vitro (Fig. 5a) (Poux et al. 2001). Недавно роль в рекрутировании PcG была также продемонстрирована для DSP1, который соединяется с GAAA мотивом, найденным во многих PREs (Dejardin et al. 2005). Наконец, белки trxG, Zeste и GAF (кодируемый Trithorax-like геном) могут помогать в рекрутировании белков PcG на их мишени.
Вновь разработанный алгоритм, базирующийся на находках, что собранные в кластеры пары GAF, Zeste и PHO/PHOL сайты характеризуют PRE, предсказывает для известных PREs с высокой вероятностью и т.о. может идентифицировать новые потенциальные PcG гены мишени в геноме Drosophila (Fig. 6b) (Ringrose et al. 2003). Семейство PRE-контролируемых генов находится в границах от хорошо известных онтогенетически важных транскрипционных факторов, необходимых для формирования паттерна, до генов, кодирующих факторы, участвующие в регуляции клеточного цикла и старении.
PRC1, будучи связанным, взаимодействует с соседними гистонами, чтобы создать стабильные комплексы молчания на PREs (Fig. 7b). H3K27me3 метки, предоставляемые с помощью PRC2 действуют как дополнительные сайты связывания для chromodomain в PC (Fig. 7c). В их отсутствие, как было показано с помощью конкуренции с растворимыми метилированными хвостовыми пептидами гистонов, PRCls диссоциируют от своих генов мишеней (Czermin et al. 2002; Ringrose et al. 2004; Wang et al. 2004). Открытие HKMT активности у PRC2 и ассоциированных гистоновых меток, типичных для молчащего хроматина, указывают на новый механизм установления PcG репрессии. Вследствие PRC2-катализируемой модификации H3K27me3, PRC1 присоединяется посредством chromodomain белка PC, чтобы стабилизировать молчание. это подкрепляется находками, что (1) H3K27me3 метки м PC ко-локализуются на политенных хромосомах и (2) связывание PC теряется у E(z) мутантов, которые лишены HKMT активности, которая модифицирует H3 с H3K27me3 метками на PREs, и служит для рекрутирования PC на его мишени (Fig. 5). Хотя такая модель безусловно привлекательна, но ситуация на PREs, по-видимому, более сложна, т.к. PRC2s и PRCls не действуют последовательно, а скорее присутствуют вместе на PREs в раннем эмбриогенезе (Fig. 5b, c). Т.о., очевидно, что метилирование H3K27 является нижестоящим событием по отношению к рекрутированию PcG, но играет критическую роль в установлении состояния молчания.
Модель, описанная выше, обнаруживает параллели с образованием гетерохроматина, где Heterochromatin Protein 1 (HP1) рекрутируется посредством своего chromodomain на H3K9me метку, генерируемую с помощью SU(VAR)3-9 (see Chapter 5). Т.о., продуктивный комплекс молчания поставляется с помощью транскрипционных факторов, чтобы определить сиквенс-элементы ДНК, но нуждается дополнительно в соответ. образом модифицированном гистоновом слое вблизи, чтобы генерировать высшего порядка репрессивную хроматиновую структуру (Fig. 5).
В ходе эволюции PREs удержали удивительно мало консервативных последовательностей. Даже среди близко родственных видов Drosophila количество, позиция и состав PREs варьируют существенно (L. Ringrose and R. Paro, unpubl.). Это указывает на то, потребности к последовательностям, также как и позиция PREs являются варьирующими и могут быть адаптированы для видо-специфичных потребностей. Тем не менее, компоненты PRC1 сильно законсервированы и они, по-видимому, используют тот же самый базовый молекулярный механизм(ы), чтобы индуцировать изменения хроматина высшего порядка на молчащих генах мишенях.

3.3 Establishment of Repressive Functions by PRC1


Способ, с помощью которого связанные с PRE PRCls взаимодействуют с промотором, чтобы предупредить транскрипцию всё ещё неизвестен. Закрепление paused РНК полимеразных комплексов на промоторах, предупреждает инициацию и было приписано PRE-PRC1 взаимодействиям, описанным для репортерных конструкций (Dellino et al. 2004). Кроме того, PRC1, как было установлено, противодействует ремоделированию нуклеосом in vitro и индуцирует компактные хроматиновые структуры. Т.о., PRC1 потенциально блокирует доступность ДНК для транскрипционных факторов и др. комплексов, необходимых для транскрипции (Francis et al. 2004). Используя алгоритм, описанный выше, было предположено, что PRE-like последовательности существуют почти во всех промоторах PcG-контролируемых генов мишеней Drosophila. Это указывает на то, что оккупация с помощью PRC1 как промотора, так и регуляторных сайтов может усиливать взаимодействия между PREs и промоторами и устанавливать стабильно репрессированную структуру хроматина, непригодную для транскрипции (Ringrose et al. 2003).
Стабильность комплексов молчания, как было продемонстрировано с помощью прикрепления посредством метилированных гистоновых хвостов, по-видимому, является характерным признаком долговременной репрессивной функции PcG белков. однако при анализе in vivo на клеточном уровне наблюдается удивительное динамическое поведение. Кластеры PcG белков в PcG тельцах, которые варьируют по размерам и составу, указывают на взаимодействие комплексов молчания в ядре онтогенетически регулируемым способом. Более того, динамический анализ in vivo GFP-маркированных PC и PH белков выявил очень высокую скорость обмена несвязанных белков с их комплексами на молчащих мишенях (Ficz et al. 2005). Эти результаты указывают на то, что долговременная репрессия прежде всего базируется на химическом равновесии между связанными и несвязанными белками скорее, чем на защите с высоким сродством ДНК-связывающих сайтов.

3.4 Preventing Heritable Repression by Anti-silencing


Соединение PRCls с PREs, по-видимому, индуцируется исходно (default), т.к. многие компоненты прикрепления PcG и ДНК-связывающих белков экспрессируются во всех клетках, а PREs глобально замалчивают репортерные гены в трансгенных конструкциях. Противодействующие белки из trxG этого не делают, фактически, функционируя не как активаторы, а скорее как анти-репрессоры (Klymenko and Miiller 2004; see Chapter 12). Т.о., чтобы поддерживать активную транскрипцию PRE-контролируемых генов, молчание на этих PRE предупреждается ткане- и стадио-специфическим образом. У Drosophila, напр., активация HOX генов контролируется с помощью раннего каскада транскрипционных факторов, кодируемых генами сегментации. Интересно, что эти факторы индуцируют транскрипцию не только HOX генов, но и также межгенных, некодирующих РНК, которые транскрибируются посредством ассоциированных PREs, и часто обнаруживаются иерархически выше или ниже (Fig. 5). Было продемонстрировано, что транскрипция посредством PREs необходима для предупреждения молчания и поддержания активного состояния репортерного гена, используемого в трансгенных конструкциях (Schmitt et al. 2005). Процесс транскрипции скорее всего ремоделирует PRE хроматин, чтобы генерировать активное состояние, характеризующееся, напр., отсутствием репрессивного метилирования гистонов и присутствием ацетилирования гистонов. Т.о., даже посредством ДНК-связывающих белков привлечение PRCl к этим специфически активированным PRE, гистоновое окружение не позволит прикрепиться PC посредством H3K27me3, и не будет возникать стабильное молчание. Т.к. молчание индуцируется исходно(default) в PcG системе, то эпигенетическое наследование паттерна дифференциальной экспрессии генов нуждается только в трансмиссии активного состояния PRE во время репликации ДНК и митозов (Fig. 7c). Как это достигается на молекулярном уровне и какие эпигенетические метки ответственны за поддержание активного состояния PRE, всё ещё открытый вопрос. Интересно, что недавно было показано, что в случае PRE Drosophila из гомеозисного гена Ubx некодирующие РНК, продуцируемые на PREs, остаются ассоциированными с хроматином и рекрутируют trxG регулятор Absent Small or Homeotic discs 1 (ASHl). Деструкция этих РНК с помощью RNAi ослабляет рекрутирование ASHl на PRE, указывая тем самым, что это взаимодействие играет важную роль в эпигенетической активации гомеозисных генов путем преодоления исходно индуцируемого с помощью PcG молчания (Sanchez-Eisner et al. 2006).

4 PcG Repression in Mammalian Development


4.1 From Cene to Chromosome Repression


Мутации в членах PRCl мышей вызывают гомеозисные трансформации осевого скелета. Это может быть связано с появлением дополнительных позвонков как следствие дерепрессии HOX генов (Fig. 2e,f) (Core et al. 1997). Кроме того, мутантные мыши обладают тяжелым комбинированным иммунодефицитом, вызываемым отсутствием пролиферативного ответа гематопоэтических клеток (Raaphorst 2005). Роль PcG белков была особенно тщательно исследована на клетках крови в свете того факта, что большинство клонов кровяных клеток характеризуется своей хорошо описанной транскрипционной программой, специфичной для данного типа клеток. Однако, клональная детерминация и ограничение так или иначе нуждаются в четком поддержании в ходе клеточных делений. Оказывается, что у PcG нокаутных мышей популяции B- и T-клеточных предшественников продуцируются нормально, указывая тем самым, что PcG контроль не участвует в установлении паттернов клон-специфичной генной экспрессии. PcG белки, однако, вносят вклад в необратимость клонального выбора скорее, чем в выбор определенного отногенетического пути.
Помимо контроля HOX генов, паттерны экспрессии которых характеризуют разные клоны кровяных клеток, PcG белки играют главную роль в контроле пролиферации. Ген bmil, ортолог Psc Drosophila был первоначально идентифицирован как онкоген, который в содружестве с myc, индуцирует у мышей lymphomagenesis (van Lohuizen et al. 1991). Белок Bmil контролирует регуляторы клеточного цикла pl6INK41 and pl9ARF (Jacobs et al. 1999). Bmil и родственный белок Mel-18 являются негативными регуляторами локуса INK4c-ARF, необходимого для контроля нормальной лимфоидной пролиферации. Неправильная регуляция этого важного checkpoint клеточного цикла влияет на апоптоз и старение мышей (Akasaka et al. 2001).
Белки PcG млекопитающих также ассоциированы с классическим эпигенетическим феноменом инактивации Х хромосом (see Chapter 17). Инактивация одной из Х хромосом в клетках самок XX сопровождается серией модификаций хроматина, которые используют PcG белки (Heard 2004). В частности, компоненты PRC2, такой как гомолог ESC, Eed (Embryonic ectoderm expression), или гомолог E(Z), Enxl (Table 1), играют главную роль в установлении гистоновых меток, ассоциированных с транскрипционным молчанием. Временная ассоциация этого PRC2 с Х хромосомой, покрытой Xist РНК, сопровождается метилированием H3K27. Напротив, eed мутантные эмбрионы мыши не обнаруживают ни рекрутирования Enxl HKMT, ни какого-либо метилирования H3K27. Однако, отсутствие этих компонентов PRC2 не ведет к полной дерепрессии всей неактивной Х хромосомы: скорее к спорадическому возобновлению экспрессии X-сцепленных генов и к увеличению эпигенетических меток, ассоциированных с активным состоянием (H3K9ac и H3K4me3) в некоторых клетках. Это скорее всего происходит из-за того, что др. частично перекрывающиеся эпигенетические механизмы действуют, чтобы гарантировать поддержание неактивности Х хромосомы.
Рекрутирование PRC2 на неактивную Х хромосому, по-видимому, зависит от Xist РНК. Т.к. ассоциация PRC2 с неактивной Х лишь временная, то возможно. что комплекс необходим только для установления эпигенетических меток (напр., H3K27me3) для поддержания молчания. Сегодня неизвестно, распознает ли непосредственно PRC1 эти метки и необходим ли для перманентного молчания неактивной Х хромосомы, но компоненты PRC1 обнаруживаются ассоциированными в неактивной Х хромосомой. Однако, метилирование ДНК, как известно, сопровождает фазу поддержания и необходимо для перманентной инактивации Х.
PRC2 специфически вовлекается в регуляцию моноаллельной экспрессии Х хромосомы как в эмбрионах, где инактивация Х хромосомы случайна, так и во внеэмбриональных тканях, где ирнактивируется всегда Х хромосома, унаследованная от отца (импринтированная инактивация Х хромосомы). Кроме того, недавно было установлено, что PRC2 участвует в регуляции некоторых аутосомных импринтируемых генов. Напр., анализ 14 импринтированных локусов из 6 несцепленных имприрнтируемых кластеров показал, что 4 из них биаллельно экспрессируются у eed мутантных мышей (Mager et al. 2003; for more detail, see Chapter 19). Интересно, что все локусы, которые теряют импринтированную экспрессию были нормально репрессированы, если наследовались от отцов, тогда как ни один из матерински репрессируемых локусов не затрагивался. Т.к. недавно было показано, что Ezh2 непосредственно взаимодействует с ДНК methyltransferases млекопитающих и необходим для их активности (Vire et al. 2006), оказалось возможным, что PRC2 играет роль в регуляции этих импринтируемых генов посредством метилирования ДНК (see Chapter 18).
Вовлечение PRC2 в регуляцию экспрессии импринтируемых генов описано также у Arabidospis, где локус PHE1 экспрессируется на более высоких уровнях с отцовского аллеля (Kohler et al. 2005). У мутантов по E(z) гомологу M2L4, материнский PHE1 аллель специфически дерепрессируется. Сходным образом MEA также регулирует свою собственную импринтируемую экспрессию: в раннем репродуктивном развитии материнский аллель MEA строго дерепрессирован у мутантов mea. Этот эффект, однако, независим от др. компонентов FIS комплекса (Baroux et al. 2006). Напротив, позднее в развитии FIS комплекс гарантирует стабильную репрессию отцовского аллеля MEA (Baroux et al. 2006; Gehring et al. 2006; Jullien et al. 2006). В этом последнем случае комплекс FIS участвует в молчании отцовских репрессируемых импринтируемых генов, сходно с ситуацией у млекопитающих. Кроме того, MEA также играет роль в поддержании экспрессии материнских PHE1 и MEA аллелей на низких уровнях (Fig. 4).
Т.к. компоненты PRC2 присутствуют у растений, беспозвоночных и млекопитающих, то PRC2 представляет собой родоначальный молекулярный модуль, необходимый для генной репрессии, которая уже присутствует у одноклеточных родоначальников растений и животных ещё до эволюции многоклеточности. Т.о.. эти примеры подтверждают, что PRC2 рекрутируется независимо для регуляции экспрессии импринтируемых генов у растений и млекопитающих, двух ветвей, где имеет место геномный импринтинг (Grossniklaus 2005).

4.2 Consequences of Aberrant Transcriptional Activation


Находка, что неправильная регуляция Bmil вызывает злокачественные лимфомы у мышей ставит вопрос, вносит ли BMI1 (компонент PRC1) человека сам по себе вклад в развитие рака сходным образом. Накапливаются доказательства, что измененная экспрессии PcG гена широко распространена в злокачественных лимфомах людей (Raaphorst 2005). Напр., уровень избыточной экспрессии BMI1 в B-клеточных лимфомах коррелирует со степенью злокачественности, подтверждая, что компоненты PRC1 играют роль в формировании раковых опухолей у людей. Однако, гены мишени для BMI1 в клетках человека, по-видимому, отличаются от тех, что в мышиных лимфоцитах, т.к. не обнаруживается явного подавления pl6INK4a, коррелирующего с избыточной экспрессией онкогена.
Избыточная экспрессия PcG наблюдается не только в гематологических злокачественных образованиях, но и также обнаруживается в твердых опухолях, включая medulloblastomas и опухоли, возникающие в печени, толстой кишке, грудных железа,легки, пенисе и простате (Fig. 8). Высокая экспрессия PRC2 маркера, Ezh2, часто обнаруживается на ранних стадиях высоко пролиферативных легочных сарком. Это указывает на то, что хорошо известный каскад инициации PRC2 iи поддержания PRC1 maintenance (Fig. 5) может также сопровождать развитие клонов опухолевых клеток.
Интересно, что компоненты PRC2 также играют критическую роль в контроле клеточной пролиферации у Arabidopsis. Хотя аберрантный рост не ведет к раку и гибели растений, строгий контроль клеточной пролиферации является

Figure 8. PRC2 Regulates Cell Proliferation in Mammals and Plants (a, b) Plant embryos derived from wild-type and mea mutant egg cells. MEA encodes a protein of the FIS complex and regulates cell proliferation. The giant mea embryo is much larger than the corresponding wild-type embryo at the same stage of development (late heart stage). Mutant embryos develop more slowly and have approximately twice the number of cell layers, (c, d) Normal and cancerous prostate epithelium. In the cancerous epithelium, Ezh2 expression is highly increased (labeled with an anti-Ezh2 antibody). Thus, both toss of E(Z) function in plants and overexpression of E(Z) function in humans can lead to defects in cell proliferation, (e, /) Control and RING1 overex-pressing rat la fibroblast cells. Overexpression of RING1 leads to anchorage-independent growth in soft agar, typical of neoplastically transformed cells. (a,b, Courtesy of J.-P. Vielle-Calzada and U. Gross-nikiaus; c,d, reprinted, with permission, from Kuzmichev et al. 2005 [©National Academy of Sciences; e,f, reprinted, with permission, from Satijn and Otte 1999 [©American Society for Microbiology].)

важным для нормального развития. У мутантов fis класса два продукта оплодотворения цветущих растений, эмбрион и эндосперм, избыточно пролиферируют приводя в результате к прекращению развития семян (Fig. 8) (Grossniklaus et al. 2001; Hsieh et al. 2003; Guitton and Berger 2005). Эффекты на клеточную пролиферацию наблюдаются также у двойных мутантов elf и swtiy двух растительных гомологов E(z). Такие растения обнаруживают нормальное развитие семян после оплодотворения, но продуцируют массу пролиферирующей, недифференцированной ткани (callus) скорее, чем листья (Chanvivattana et al. 2004).
Хотя неизвестно, как PRC2 контролирует клеточную пролиферацию у растений, скорее всего он использует взаимодействия с RBR1, растительным гомологом белка Retinoblastoma (Rb) (Ebel et al. 2004; Mosquna et al. 2004). Мутации генов класса FIS не только вызывают дефекты пролиферации во время развития семян после опыления, но и также необходимы для предупреждения пролиферации эндосперма в отсутствие оплодотворения. Этот последний аспект фенотипа является общим с rbrl мутантами, это указывает на связь с Rb путем. Удивительно, но взаимодействие между Rb путем и PRC2 было также описано у млекопитающих (Bracken et al. 2003), это иллюстрирует консервацию регуляторных сетей между растениями и животными.

4.3 Maintaining Stem Cell Fate


Стволовые клетки играют всё увеличивающуюся роль в медицине. Их потенциал предоставлять предшественников для заживления поврежденрнях тканей делает их очень ценным инструментом регенеративной медицины. Не удивительно, что они довольно хороошо охарактеризованы для клонов кровяных клеток. Hematopoietic stem cells (HSCs) поддерживают пул кровяных клеток благодаря само-обновлению, а также за счет продукции дочерних клеток, которые дифференцируются в лимфоидные, миэлоидные и эритроидные клоны. Ниши стволовых клеток во взрослом костном мозге поставляют клетки со специфическими внешними сигналами для поддержания их судьбы. С др. стороны, внутренне присущие клеткам сигналы для поддержания "stem cellness" состояния, по-видимому, имеют отношение к PcG системе.
Мышиные мутации. затрагивающие гены PRC1 (напр., bmil/mel-18, mphl/rae28t и m33; see Table 1) страдают от различных дефектов гематопоэтической системы, таких как гиперплазия (т.e., повышенная клеточная пролиферация) в селезенке и тимусе, редукция B и T клеток и нарушенная пролиферативная реакция лимфоидных предшественников на цитокины. Потребность в Bmil и Mel-18 для само-обновления стволовых клеток во время различных стадий развития подтверждает изменяющийся пул генов мишеней между эмбриональными и взрослыми стволовыми клетками.
Система PcG необходима также для neural stem cells (NSCs), как указывают нейральные дефекты, обнаруживаемые у bmil мутантов мыши (Bruggeman et al. 2005; Zencak et al. 2005). В частности, мыши обнаруживали деплецию церебральных NSCs постнатально, что указывает на потребность in vivo Bmil для возобновления NSC. Как было установлено для гематопоэтической системы, очевидно, что поддержание эмбриональных NSC находится под контролем другой PcG сети, чем само-обновление NSC у взрослых.
Внешние сигналы, подобные сигнальному каскаду sonic-Hedgehog модулируют реакцию Bmil в NSCs и гарантируют proliferative/self-renewal способность (Leung et al. 2004). Идентификация этих внешних сигналов, контролирующих PcG репрессию, стала возможна благодаря анализу развития cerebellar granule neuron progenitors (CGNPs). Постнатальные волны пролиферации индуцируются благодаря передаче сигналов Sonic hedgehog (Shh), секретируемого клетками Пуркинье. Сигнал Shh разветвляется, чтобы контролировать N-Myc и Bmil уровни (Fig. 9). Т.о., Bmil-дефицитные CGNPs обнаруживают дефектную пролиферативную реакцию

Figure 9. Sonic Hedgehog Signaling Maintains Proliferation/Self-renewal of Cerebellar Progenitor Cells The Shh signaling cascade regulates both the Rb pathway and the p53 pathway via Bmil control of the pl6/p!9 proliferation checkpoint. Inhibition of Smoothened (Smoh) by the Shh receptor Patched (Ptch) results in downstream signaling in the nucleus. One part of the signal induces N-Myc, Cyclin D1, and D2, whereas the other part activates Bmil via the Gli effectors. (Adapted from Valk-Lingbeek et al. 2004.)

на стимуляцию Shh. Сигнал Shh способен контролировать пролиферацию этих стволовых клеток путем модулирования как нижестоящего Rb пути (посредством N-myc и Bmil/pl6NK4a) так p53 пути (посредством Bmil/pi19ARF). Этот механизм объясняет, почему гиперактивация передачи сигналов Shh ведет к развитию medulloblastomas (Leung et al. 2004). HSCs регулируются с помощью сходного Indian hedgehog-контролируемого пути. В NSCs экспрессия локусов Hoxd8, Hoxd9 и Hoxc9 находится под контролем Bmil. Соотв. профиль HOX экспрессии обеспечивает необходимую судьбу стволовым клеткам.
В самом деле, т.к. стволовые клетки представляют собой определенную, детерминированную клеточную судьбу, то не удивительно, что PcG система поддерживает эти специфические судьбы митотически наследуемым способом. Пока неясно, играет ли PcG роль в поддержании стволовых клеток у растений. Предположительно, однако, репрограммирование растительных клеток, которые тотипотентны и обладают потенциалом формировать полный новый организм в соотв. условиях, д. использовать PcG регуляцию. В самом деле растения, лишенные E(z) гомологов CLF и SWN продуцируют массу недифференцированных клеток после оплодотворения, это указывает на то, что PcG необходимы для поддержания дифференцированного состояния (Chanvivattana et al. 2004).

5 Conclusion and Outlook


It has been remarkable to follow the development of our understanding of PcG epigenetic regulation from the initial genetic identification of a Drosophila mutant possessing additional sex combs on the second and third leg. This eventually led to the discovery of a new class of regulators found to be required for fundamental epigenetic processes such as vernalization in plants and silencing of the mammalian X chromosome. Control of genetic information is highly influenced by chromatin structure and composition of histones in their various modified forms. The proteins of the PcG are direcdy involved in generating epigenetic marks, for instance, H3K27me3, as a consequence of developmental decisions. The same group "reads" (i.e., shows high affinity to), through the action of the PRC1 proteins, these epigenetic marks and translates them into a stable, transcriptionally repressed state. In the model organism Drosophila, we have a relatively clear picture of how PcG complexes are anchored at PREs, for a defined group of target genes that are subject to long-term repression. However, to date, no PREs have been identified in other organisms. Although the basic function of PcG proteins remains the same, it is unclear which part of the plant and vertebrate genomes is subjected to their repression and how they are targeted to their site of action. Additionally, we need to get a better understanding of how an apparently dynamic group of proteins can impose a stable state of transcriptional repression through a chemical equilibrium.
The other major question of the PcG research focuses on the heritability of the repressed state, the very essence of epigenetics. What is the identity of the molecular marks required to transmit a state of gene expression through DNA replication and mitosis? We know that the cooperation of trxG and PcG proteins maintains active or silent states of gene expression. Do both states need a corresponding epigenetic mark that is transmitted to daughter cells, or is only one sufficient, while the other represents the default state? The mechanism by which PcG proteins impose silencing on transcription during the interphase of the cell cycle has become increasingly clear. In the future, the focus of research will be on how the information regarding a state of gene expression endures the DNA replication process and is faithfully transmitted to the daughter cells following mitosis.
Сайт создан в системе uCoz